本文摘要：摘要：生物防治不僅作為植物寄生線蟲安全有效的防治措施，而且其具有降低化學農藥施用量和減少環境污染的作用。木霉菌作為一種生防潛力巨大的線蟲病防治真菌，已被廣泛研究并應用于植物寄生線蟲的防治。本文主要從木霉防治線蟲病的直接和間接生防機制的視角，綜述了木
摘要：生物防治不僅作為植物寄生線蟲安全有效的防治措施，而且其具有降低化學農藥施用量和減少環境污染的作用。木霉菌作為一種生防潛力巨大的線蟲病防治真菌，已被廣泛研究并應用于植物寄生線蟲的防治。本文主要從木霉防治線蟲病的直接和間接生防機制的視角，綜述了木霉對線蟲的重寄生作用、毒殺作用以及木霉對植物的誘導抗性、促生作用等多種協同防治植物寄生線蟲的機制，展望了今后需要繼續擴大對殺線木霉資源種類的調查和挖掘、木霉菌對植物寄生線蟲的作用機理以及從分子水平上加深對木霉防治線蟲病機制的研究，旨在為科學利用木霉菌防治植物線蟲病提供參考。
關鍵詞：木霉;線蟲;生物防治;互作機制;直接機制;間接機制
植物寄生線蟲(Plantparasiticnematodes，PPNs)是引起植物病害的一類重要經濟類有害生物[1,2]。據估計，因其危害在全球農業生產中造成的經濟損失每年高達1570億美元[3]。植物寄生線蟲引起的線蟲病已成為我國主要的農業病害之一，嚴重阻礙我國糧食、經濟作物安全生產。
長期以來，化學殺線蟲劑一直是防治植物線蟲病害的主要措施，然而大量使用化學藥劑不僅會使線蟲產生抗藥性，還會造成嚴重的環境污染問題并危害人體健康，進而導致大多數高毒類殺線劑已被禁用或限制使用[4]。同時，隨著人們綠色環保意識的提高和無公害生產的要求，以及生物防治因能有效減少化學農藥的使用并減輕環境污染已逐漸成為植物寄生線蟲安全有效的防治措施。
木霉菌Trichodermaspp.是一類廣泛分布于土壤中的有益菌，因在線蟲病防治中極具生防潛力而被廣泛研究[1,2,46]。近年來，木霉對植物線蟲病的防治機理已成為木霉生防研究中的重要科學問題。本文主要從木霉防治線蟲病的直接和間接生防機制的視角，綜述了木霉對線蟲的重寄生作用、毒殺作用及其對植物的誘導抗性和促生作用等多種協同防治植物病原線蟲的機制，以期為進一步深入研究生防木霉菌防治植物線蟲病提供新思路。
1木霉菌防治線蟲的直接作用機制
1.1木霉菌重寄生作用
木霉菌通過重寄生作用進行識別、接觸、纏繞和穿透線蟲來抑制或溶解寄主體壁，是木霉最重要、最廣泛的生防機制之一[7]。研究表明[1,2,79],木霉菌胞外酶在木霉菌重寄生作用過程扮演著重要的作用，木霉菌在重寄生過程中分泌幾丁質酶、蛋白酶、葡聚糖酶等一系列水解酶來消解線蟲孢囊、卵、體壁，其中以幾丁質酶和蛋白酶尤為重要。
目前，已發現哈茨木霉T.longibrachiatum[10]、康寧木霉T.koningiopsis[11]、綠色木霉T.viride[6]和長枝木霉T.longibrachiatum[1]等菌株可以有效抑制根結線蟲的繁殖，本課題組前期分離篩選出適宜于西部干旱生態環境條件下的具有自主知識產權的一株長枝木霉T6殺線菌株，并發現其對禾谷孢囊線蟲Heteroderaavenae孢囊、卵和幼蟲均具有較強的寄生和致死作用，利用顯微鏡觀察發現其寄生后能夠導致孢囊、卵和線蟲體壁破裂和溶解[2,4,12]，進一步研究發現其能夠通過提高和分泌大量幾丁質酶和蛋白酶導致孢囊體壁和卵殼溶解，以及能夠分泌蛋白酶導致南方根結線蟲Meloidogyneincognita幼蟲體壁溶解和線蟲死亡[1]。
1.1.1木霉菌幾丁質酶殺線作用及機理
幾丁質酶是木霉菌胞外酶的重要組成成分之一，主要由內切幾丁質酶(Endochitinase)和外切幾丁質酶(Exochitinase)組成，其在重寄生線蟲過程中發揮著重要的殺線功能。木霉菌分泌的幾丁質酶在線蟲寄生和致死作用中已有相關研究，Sahebani等[10]報道爪哇根結線蟲M.javanica卵能夠誘導哈茨木霉BI幾丁質酶活性的升高，進而提高其侵染卵的活力。Baldoni等[11]從51株分離的真菌中篩選出康寧木霉UFSMQ40具有較好的殺線活性，通過以膠體幾丁質作為誘導劑提取的幾丁質酶發酵液對南方根結線蟲、爪哇根結線蟲有較高的致死率。
Szabo等[13]研究表明，18株木霉菌株中有株木霉菌對植物寄生線蟲具有較強的寄生作用，其中哈茨木霉SZMC1647對植物寄生線蟲卵具有較強的寄生作用，進一步利用實時熒光定量PCR分析哈茨木霉SZMC1647幾丁質酶基因chi185(chit42)和chi1812(chit33)的表達量發現，chi18(chit42)和chi1812(chit33)在不同時間點存在較明顯的表達量差異，但總體而言，哈茨木霉與線蟲互作過程中幾丁質酶基因高表達，表明哈茨木霉與線蟲互作過程中，線蟲卵可能誘導哈茨木霉幾丁質酶基因chi18(chit42)和chi1812(chit33)顯著上調表達，進一步調控其產幾丁質酶的能力增強從而促進線蟲卵體壁溶解，然而，有關chi185chit42)和chi1812(chit33)基因的具體功能還有待后期進一步驗證。
朱玉婷等[14]從煙草南方根結線蟲卵上分離到株可產幾丁質酶的長枝木霉HBF1，從菌株HBF1中克隆到個幾丁質酶基因，命名為TlChi46，初步預測該基因編碼氨基酸的個數、理論分子量及等電點分別為423個、45.9kDa、5.23，通過構建TlChi46與昆蟲寄生菌幾丁質酶基因的進化樹明確了二者親緣關系可能相對較遠，該基因能否合成幾丁質酶并殺死線蟲仍待進一步驗證。
1.1.2木霉菌蛋白酶殺線作用及機理
木霉菌胞外蛋白酶是另一類重要的細胞壁降解酶，對植物病原線蟲的生物防治也有著重要作用，木霉與植物病原線蟲互作時，木霉分泌的蛋白酶能失活鈍化寄主線蟲體壁，降解病原線蟲體壁中蛋白質組分等途徑，與其它細胞壁降解酶協同發揮對線蟲的防治作用[3,15]。
Geremia等[16]從哈茨木霉IMI206040中分離到一種堿性絲氨酸蛋白酶Prb1，分子量31kD，等電點9.2。隨著分子生物技術水平的飛速發展，編碼木霉菌蛋白酶prb1基因已克隆，同時過表達prb1基因的突變體能夠增強木霉菌的生防功能[17]。另有研究表明[18]，哈茨木霉能毒殺南方根結線蟲二齡幼蟲，并且過表達堿性絲氨酸蛋白酶prb1基因的哈茨木霉轉化菌株對南方根結線蟲的毒殺作用顯著增強。另外，Suarez等從哈茨木霉CECT2413菌株中發現種蛋白酶PRA1，其功能與胰蛋白酶類似，該發酵粗提蛋白液顯著降低了線蟲卵的孵化率。Stleger等[20]研究表明，微生物胞外蛋白酶是大部分蟲生真菌侵染初期產生的唯一胞外酶，而幾丁質酶則是侵染后期產生的最主要胞外酶。
Chen等[21]從擬康寧木霉T.pseudokoningiiSMF2中分離到種線蟲體壁降解酶絲氨酸蛋白酶(Cuticledegradingserineprotease)Spr，該酶對根結線蟲卵的孵化率表現為顯著降低，并且對線蟲二齡幼蟲表現出較強的毒殺作用。另外，天冬氨酸蛋白酶在木霉菌重寄生和植物共生作用中也發揮著重要作用[22]。Szabó通過測定哈茨木霉與線蟲卵互作中的13個肽酶編碼基因的表達水平，發現酸性絲氨酸蛋白酶pra1、天冬氨酸蛋白酶p6281和p9438、金屬內肽酶p7455和絲氨酸蛋白酶p5216均高表達，這預示著哈茨木霉蛋白酶基因pra1、p6281、p9438、p7455和p5216可能在與卵互作過程中發揮著關鍵殺線作用[23]。
1.2木霉菌毒殺作用
毒殺作用是木霉防治線蟲的另一種重要的直接生防機制，在木霉菌生長過程中，產生多種具有毒殺活性的次級代謝產物，這些毒殺性的代謝產物能夠殺死線蟲[24]，達到防治植物病原線蟲病的目的。目前已報道的具有殺線活性的木霉菌主要有長枝木霉、綠色木霉、哈茨木霉、鉤狀木霉T.hamatum、深綠木霉T.atroviride及康寧木霉[2431]。Zhang等[32]采用響應面法來優化長枝木霉T6的殺線發酵液的條件。
結果表明，T6培養濾液在初始pH為6.06、接種量為1.62mL、培養時間為7.15d的發酵條件下殺線蟲活性最高，達92.42%，溫室試驗中T6培養濾液在小麥播種后70d的生防效果為83.88%。Yang等[33]對所分離的329株木霉菌株進行了毒殺全齒復合線蟲測定，結果表明其中15株木霉菌對全齒復合線蟲具有較強的毒殺活性。目前已發現木霉所產生的毒殺物質分為兩類，一類是小分子和易揮發性物質，包括芳香族化合物、聚酮化合物、丁烯酸內酯類及萜烯類等[34,35]。另一類是大分子代謝產物，包括肽Peptailbols、酶類等[36]。
已有報道表明目前從木霉菌中提取的殺線物質主要有木霉菌素[32]、乙酸[24]、膠酶毒素[37]和肽環孢菌素[38]等成分;同時，梁志懷等[39]利用GCMS檢測和分析了木霉菌TUV13菌株殺線活性成分，共獲得40多種化學成分，其中主要以烷烴類成分的種類最多，另外還包含有機酸類、酯類、酮類和類固醇類等有機化合物。綜上，木霉菌發揮生物防治的功能主要為重寄生作用和毒殺作用，其主要機制為木霉菌在生長過程中分泌的胞外酶和次級代謝產物來協同發揮生物防治的功能[40,41]。
2木霉菌防治線蟲的間接作用機制
早期對木霉生防機制的研究主要集中在木霉與寄生線蟲之間的直接作用，而對于木霉與寄主植物相互作用增強植物抗病性的研究較少。近年來，研究人員發現木霉菌可以通過誘導植物防御系統與植物建立共生關系，增強植物對線蟲病的抗性，該機制稱為木霉誘導的植物系統抗性[4244];另外，木霉菌與植物相互作用、相互共存和互利共生，木霉菌能夠加速植物吸收土壤中的養分，從而促進植物生長，增強植物抵抗逆境脅迫的能力，這便是木霉菌防治線蟲病的間接作用機制。
3木霉防治線蟲病存在的問題及展望
3.1加大對殺線木霉種類調查和挖掘近年來，科研工作者發現了許多具有殺線蟲作用的木霉菌，雖在前人研究的基礎上開展了很多探索性的工作，但對有殺線潛力的木霉種類挖掘還不夠，這就要求科研工作者利用大自然廣泛的微生物資源，充分調查和挖掘具有殺線蟲作用的木霉種類的認識，將更多的真菌資源有效地應用于線蟲防治，以開拓我國線蟲生物防治的新領域。
3.2明確殺線木霉對植物寄生線蟲的毒殺機制迄今為止，已發現木霉次級代謝代謝產物能有效殺死線蟲，然而，已發現具有殺線蟲作用的木霉次級代謝產物種類較少。另外，關于木霉次級代謝產物中有效的殺線活性物質如何殺死線蟲，其作用機理尚不明晰。因而，國內外科研工作者有待于更深入、更系統地探明木霉代謝產物防治線蟲的機制，以期更好地發揮生防木霉的殺線作用。
3.3揭示木霉防治線蟲的分子作用機制
木霉防治植物線蟲病的機制包括重寄生、毒殺的直接防治作用及誘導植物產生系統抗性、促進植物生長的間接防治作用在內的多種機制，田間防治中木霉往往以多種機制協同發揮防效作用。因而，明確木霉防治線蟲病的機制是科學應用木霉生物防治線蟲病的關鍵。近年來，眾多科研工作者對木霉防治線蟲已從木霉菌種、胞外酶、次級代謝物質的分離鑒定等方面開展了研究，然而，在木霉胞外酶、次級代謝產物的種類以及調控其合成的基因、木霉誘導植物產生抗病性的機制還需要更深入的研究。隨著分子生物學的不斷發展，后基因組時代已然到來，基于基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組學技術對于挖掘木霉胞外酶、次級代謝產物的種類以及調控其合成的基因、以及開展木霉誘導植物產生抗病性機制的研究工作，可為木霉的田間應用提供更多的理論依據。
參考文獻
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作者：王秀娟，張樹武，徐秉良
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