本文摘要：摘要：為探究水產養殖中養殖不同物種對水體和沉積物中細菌群落的影響，本文以養殖克氏原螯蝦(Procambarusclarkii，PC)和中華鱉(Pelodiscussinensis，PS)的水體和沉積物樣品為研究對象，利用基于16SrRNA基因的高通量測序技術，對細菌群落多樣性和群落組成進行分析，并結
摘要：為探究水產養殖中養殖不同物種對水體和沉積物中細菌群落的影響，本文以養殖克氏原螯蝦(Procambarusclarkii，PC)和中華鱉(Pelodiscussinensis，PS)的水體和沉積物樣品為研究對象，利用基于16SrRNA基因的高通量測序技術，對細菌群落多樣性和群落組成進行分析，并結合環境因子，探究水產養殖對細菌群落的影響。結果顯示，水體和沉積物中細菌群落的α多樣性均呈現PS>PC的顯著差異(P<0.05)。非度量多維尺度分析的結果顯示，PC和PS區的水體和沉積物細菌群落結構均呈現明顯差異。冗余分析(RDA)的結果表明，水體氨氮(NH+4⁃N)和硝酸鹽氮(NO-3⁃N)是影響水體細菌群落結構的最主要環境因子，沉積物總氮(TN)、總磷(TP)和有機碳(OC)均對沉積物細菌群落結構有顯著影響(P<0.05)。PC和PS區中的細菌隸屬于34門、114綱、258目、504科和955屬，水體中共篩選出了11個優勢菌門(相對豐度>0.5%)，沉積物中篩選出了13個。2個養殖區域的水體樣品中共篩選出了15個優勢(相對豐度>1%)操作分類單元(OperationalTaxonomicUnit，OTU)，其中有9個具有脫氮除磷或去除有機質的作用，它們分別屬于叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、放線菌目(Actinomycetales)和沉積桿菌屬(Sediminibacterium)。整體上，這9個優勢OTUs在PC區中的相對豐度更高，并且與氨氮(NH+4⁃N)和硝酸鹽氮(NO-3⁃N)的相關性較強。同時，在沉積物樣品中篩選出了7個優勢OTUs，其中有3個主要參與氮循環，它們分別屬于Dechloromonas屬、Prolixibacteraceae科和厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)。此外，在水體樣品中發現了3個優勢OTUs為致病菌，分別屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)和多核桿菌屬(Polynucleobacter)。綜合以上分析，養殖不同物種會對水體和沉積物中細菌群落多樣性和結構產生不同影響。
關鍵詞：水產養殖;細菌;高通量測序技術;群落多樣性;群落組成
水產養殖業是農業的重要組成部分，也是全球最大的食品產業之一[1]。近年來，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)、中華鱉(Pelodiscussinensis)等重要淡水物種的人工養殖發展迅速[2]。
克氏原螯蝦隸屬于十足目(Decapoda)、螯蝦科(Astacidae)[3]，是我國養殖最廣的淡水螯蝦品種[4]。中華鱉屬龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Trionychidae)[5]，在我國分布廣泛，藥用價值極高，是我國重要的淡水養殖物種之一[6]。細菌是生態系統中的重要組成部分[7]。在水產養殖系統中，細菌既能作為分解者降解養殖動物無法利用的有機質，又可以作為養殖動物的直接或間接餌料[8]。此外，細菌群落對環境的變化十分敏感，其與周圍的環境因子相互作用、往復調控[9]。
在水產養殖的水體中，細菌群落的結構、多樣性等均隨水環境的變化而改變，水體細菌群落的變化又會對水環境造成影響[10]，因此，對養殖環境中的水體細菌群落進行深入研究具有重要意義[11]。除養殖水體外，沉積物也是細菌附著的主要介質[12]。大量的細菌富集于沉積物中，通過同化、異化等代謝過程來影響沉積物中營養鹽的分布、轉化和利用等[13]。因此，沉積物中的細菌群落可以作為水環境變化和演替的重要標志[14]，探究水產養殖對沉積物中細菌群落的影響也具有重要意義。近年來，快速發展的高通量測序技術由于其具有通量大、測試結果準確等優點成為準確、便捷和全面地研究養殖系統中的細菌群落結構和組成的研究手段之一[15]。
胡常巨等人[16]利用高通量測序技術探究網箱養殖對水環境細菌群落的影響，表明養殖活動顯著改變了養殖水環境中浮游細菌群落結構。陶玲[11]利用高通量測序技術研究發現，稻田—池塘復合循環水養殖系統與常規池塘養殖系統中的細菌群落結構存在差異。但目前的研究大多是對比水產養殖(或某種特殊的養殖系統，如循環水養殖系統)和天然水體細菌群落的差異[17—18]，鮮有研究利用高通量測序技術，對養殖不同物種的水環境細菌群落進行深入探究。而水產養殖不同物種對水環境中的細菌群落可能產生完全不同的影響[19]。不同物種的生活習性和管理方式等可能會對細菌群落產生不同的影響，而不同的細菌群落又可能會對養殖水環境或作物產生不同的影響[20]。
因此，利用高通量測序技術對養殖不同物種的水體和沉積物中細菌群落進行深入研究，對探究水產養殖對水環境中細菌群落的影響有著重要意義�？耸显r和中華鱉是兩種在生理特性、生活習性及管理方式等方面具有明顯差異的淡水養殖物種。克氏原螯蝦是雜食性動物，生長發育較快，挖洞能力強，抗逆力很強，能生活在一些輕度污廢水中[21]。
中華鱉以肉食為主，生長發育相對緩慢，繁殖力低，具有上岸曬背的習性[5，22]。因此，我們預期養殖這兩種作物會對水體和沉積物產生不同的影響。綜上，本研究以養殖不同物種(克氏原螯蝦和中華鱉)的水體和沉積物細菌群落為研究對象，以基于16SrRNA基因的高通量測序技術為研究方法，揭示了養殖不同物種的水體和沉積物間細菌群落α多樣性、群落組成和優勢細菌的異同，以期為養殖環境的維護和改善提供參考。
1材料與方法
1.1樣品采集
本次研究的水體和沉積物樣品均采集于江蘇省省級精品漁業園(119°01′48″E，32°13′51″N)的多年輪作稻田(Oryzasativa：亞洲栽培稻)濕地。在實驗開始前，利用不銹鋼板將該濕地劃分為兩個區域，分別投放克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)和中華鱉(Pelodiscussinensis)，并根據養殖物種分別命名為PC和PS區。該濕地首次嘗試稻-蝦/鱉共作的模式。
PC和PS區均于2019年5月上旬進行水稻播種;6月底水稻插秧;7月上旬水稻進入返青分蘗期，此時投放幼蝦(20—30kg/hm2)和幼鱉(1500只/hm2);11月底收割水稻(共產出水稻360kg);12月底—2020年1月初打撈克氏原螯蝦和中華鱉。
為保證PC和PS區中的本底微生物多樣性和結構相似，兩塊稻田濕地的面積(5328m2)、種植密度(46%)、管理方式和灌溉用水等均保持一致。為探究養殖不同作物對水體和沉積物細菌群落的影響，于養殖周期結束后(2020年1月)在上述2個區域中，各選擇6個采樣點，分別利用不銹鋼采水器(HAD-WB-SS)和抓斗式采泥器(CN⁃100)采集水體(水面以下30—50cm)和表層沉積物(0—3cm)樣品。
為避免水稻根系微生物對沉積物樣品的影響，在采集沉積物樣品時，我們盡量避開水稻生長的地方，并確保所采集的樣品中無水稻根系。收集到樣品后，利用保溫箱(4℃)冷藏，快速運回實驗室。利用YSI6600(YSI6600，YellowSprings，美國)對水體的溫度(T)、pH和溶解氧濃度(DO)分別進行原位測定。
1.2樣品預處理
樣品運回實驗室后，利用真空冷凍干燥機(LABCONCO，美國)凍干沉積物樣品，并在樣品凍干后進行研磨和過篩(35目土壤篩)。取部分水體樣品，用0.22μm的硅膠微孔濾膜進行過濾，分別冷凍保存濾膜和濾液于超低溫冰箱中(-70℃)。
1.3樣品理化指標測定
水體的總氮(TN)和總磷(TP)濃度使用原水樣采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)進行測定[23]。水體的氨氮(NH+4⁃N)和硝酸鹽氮(NO-3⁃N)濃度使用過濾后的水樣通過流動注射儀(San++，SKALAR，荷蘭)測定[24]。水體化學需氧量(COD)使用原水樣利用重鉻酸鉀法(HJ828—2017)[25]進行測定。沉積物的總氮(TN)和總磷(TP)濃度也采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)進行測定[23]。使用重鉻酸鉀氧化-分光光度法(HJ615—2011)[26]測定沉積物的有機碳濃度(OC)。
1.4DNA提取及高通量測序
水體濾膜和沉積物樣品分別采用E.Z.N.A.
采用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證所提取的DNA樣品。使用引物對515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG⁃3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT⁃3′)對16SrRNA基因的高可變區V4區進行擴增[29]。PCR擴增體系為20μL(0.8μL上下游引物、10ngDNA模板、2μLdNTP、0.4μLFastPfu酶，及無菌蒸餾水)，PCR擴增程序為95°C預變性2min，25次的擴增循環(95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s)，并最終在72°C下延伸5min[30]。
PCR產物合并后通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗。PCR產物經純化和定量后，由諾禾致源生物科技有限公司(北京)利用IlluminaMiseq測序平臺進行測定。本研究所獲得的所有細菌基因序列均已上傳到NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)數據庫中，序列登記號為PRJNA698288。
測序結果使用QIIME(v1.9.1)進行處理[31]，使用“trim”功能篩選出截斷讀數超過10bp且配對成功的序列[32]。然后使用FLASH(v1.0.0)拼接序列[33]，再使用QIIME(v1.9.1)中的“vsearch”功能查找并去除嵌合體[34]，使用“pick_de_novo_otus.py”命令，根據3%的差異原則劃分操作分類單元(OperationalTaxonomicUnits，OTU)[35]。
對照SILVA16SrRNA基因數據庫(SILVA123_QIIME_release，2016)[36]，匹配分類學信息。使用“filter_taxa_from_otu_table.py”命令去除非細菌序列和序列數不高于總序列數0.0005%的稀有OTU[37]，使用“parallel_align_seqs_pynast.py”命令計算進化樹，最后使用“multiple_rarefactions_even_depth.py”命令對最終完善的文件進行重采樣，并導出最終的OTU表。
基于OTU表，在QIIME(v1.9.1)中使用“alpha_diversity.py”計算ObservedOTUs和Shannon指數來反映細菌群落的α多樣性。再利用QIIME(v1.9.1)中的“beta_diversity.py”計算WeightedUnifrac距離矩陣來反應細菌群落的β多樣性。
1.5多元統計分析
本研究利用軟件GraphPadPrism(v8)繪制箱型圖來反映細菌群落α多樣性的高低�；贠TU表，利用R(v3.5.3)中的程序包“Vennerable”進行Venn圖的繪制。根據β多樣性矩陣，使用R(v3.5.3)中的“vegan”程序包進行非度量多維尺度分析(Nonmetricmultidimensionalscaling，NMDS)，來可視化不同樣品間群落結構的差異和相似性。為探究細菌群落與環境因子的相關性關系，利用R(v3.5.3)中的“vegan”程序包進行冗余分析(redundancyanalysis，RDA)。
將平均相對豐度大于0.5%的細菌門作為優勢菌門，并利用軟件GraphPadPrism(v8)繪制堆疊圖。篩選平均相對豐度大于1%的OTUs作為優勢OTUs，使用軟件IBMSPSSStatistics(v22.0)分析優勢OTUs與環境因子的相關關系(Pearson相關)，并利用R(v3.5.3)中的“Heatmap”程序包分別繪制熱圖。采用獨立樣本T檢驗對水體樣品和沉積物樣品指標進行差異顯著性檢驗。
2結果與分析
2.12個養殖區域的水體和沉積物環境變量
2個養殖區域的水體和沉積物環境變量均存在一些差異。其中，PC區的水體NH+4⁃N和NO-3⁃N濃度均顯著高于PS區(P<0.05)。水體TN、TP和COD濃度均呈現PC>PS的趨勢。對于沉積物，PC區的TN、TP和OC濃度均顯著高于PS區(P<0.05)。
2.2水產養殖不同物種的水體和沉積物中細菌群落的α多樣性特征2個區域細菌群落的α多樣性，對于水體和沉積物樣品，PS區的ObservedOTUs和Shannon指數均顯著(P<0.05)高于PC區。即PS區中水體和沉積物細菌群落的α多樣性均顯著高于PC區。對于養殖水體，2個區域共有2639個相同的OTUs，PS區的特有OTU數為2588遠大于PC區的195。
對于沉積物，PC和PS區的OTU數基本一致，絕大多數OTUs為兩區域共有，但PS區的特有OTU數(408)仍明顯高于PC區(143)。由此可見，沉積物中的共有OTU數占總OTU數的比重大于水體。并且，PS區中水體和沉積物的特有OTU數均高于PC區。
對于水體，PC區的特有OTUs共分類為15個細菌門，PS區的特有OTUs共分類為16個細菌門。兩個區域的特有OTUs均是屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)的最多(PC：33個，PS：280個)，并且SR1僅在PS區中觀測到。對于沉積物，PC區的特有OTUs共分類為13個細菌門，其中屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)和β⁃變形菌綱(Betaproteobacteria)的特有OTUs均為19個明顯高于其他門。PS區的特有OTUs共分類為14個細菌門，其中屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)的特有OTUs最多(70個)。
2.3水產養殖不同物種的水體和沉積物中細菌群落結構
PC和PS區的細菌群落分別聚集，且2個區域無重疊，表明PC和PS區的細菌群落結構存在明顯差異。冗余分析(RDA)的結果顯示，對于水體，第一主軸的解釋率為91.4%，遠大于第二主軸，NO-3⁃N在第一主軸上的投影長度最長，NH+4⁃N次之。對于沉積物，RDA的第一和第二主軸共有高達99.73%的解釋率，并且OC、TN和TP均對沉積物的細菌群落結構有顯著(P<0.05)影響。
2.4水產養殖不同物種的水體和沉積物中細菌群落組成
本研究共獲得1487129條序列、7247個OTUs，它們屬于細菌的34門、114綱、258目、504科和955屬。2個區域的優勢(相對豐度>0.5%)細菌門/亞門。水體樣品中共有11個優勢菌門，這11個門的相對豐度和占到所有細菌的91.46%—98.54%。沉積物樣品中共有13個優勢菌門，其相對豐度和占到總細菌的77.52%—84.98%。將相對豐度>1%作為篩選優勢OTUs的閾值，水體細菌群落中共篩選出15個優勢OTUs，而沉積物細菌群落中僅篩選出7個優勢OTUs。
水體細菌群落優勢OTUs中，6個屬于β⁃變形菌綱(Betaproteobacteria)、5個屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)、3個屬于放線菌門(Actinobacteria)和1個屬于α⁃變形菌綱(Alphaproteobacteria)。
PS區中OTU3394(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU12347(腐螺旋菌科，Saprospiraceae)、OTU12385(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU15668(嗜甲基菌屬，Methylophilus)、OTU16336(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU20544(叢毛單胞菌科，Comamonadaceae)、OTU38268(黃桿菌屬，Flavobacterium)、OTU41298(放線菌目，Actinomycetales)、OTU42336(沉積桿菌屬，Sediminibacterium)、OTU52126(多核桿菌屬，Polynucleobacter)和OTU61118(黃桿菌屬，Flavobacterium)的相對豐度顯著低于PC區(P<0.01)，OTU94966(腐螺旋菌科，Saprospiraceae)的相對豐度顯著高于PC區(P<0.001)。沉積物優勢OTUs中，5個屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)、1個屬于β⁃變形菌綱(Betaproteobacteria)、1個屬于綠彎菌門(Chloroflexi)。這7個優勢OTUs的相對豐度在兩個區域之間均存在顯著差異(P<0.001)。
PS區中OTU11213(Dechloromonas屬)和OTU59770(Prolixibacteraceae科)的相對豐度均顯著高于PC區(P<0.001)。而OTU1482(擬桿菌門，Bacteroidetes)、OTU89828(擬桿菌門，Bacteroidetes)、OTU97626(擬桿菌門，Bacteroidetes)、OTU103576(擬桿菌門，Bacteroidetes)和OTU103578(厭氧繩菌科，Anaerolineaceae)的相對豐度則是PC區顯著更高(P<0.001)。
2個養殖區域的優勢OTUs與環境因子的相關性(Pearson相關)。總體來看，水體NH+4⁃N和NO-3⁃N與水體優勢OTUs相關性較強。其中OTU3394、12347、12385、15668、16336、20544、38268、41298、42336、52126和611181均與NH+4⁃N和NO-3⁃N顯著正相關(P<0.01)。而OTU94966與NH+4⁃N和NO-3⁃N顯著負相關(P<0.01)。
對于沉積物，TN、TP和OC濃度均與優勢OTUs有較強的相關性。整體上，TP與優勢OTUs的相關性較TN和OC弱。OTU11213和OTU59770與TN和OC均顯著負相關(P<0.05)，OTU1482、OTU89828、OTU97626、OTU103576和OTU103578與TN和OC均顯著正相關(P<0.01)。
3討論
3.1水產養殖不同物種對水體和沉積物中細菌群落多樣性及結構的影響
本研究中，PS區的水體和沉積物細菌群落α多樣性均顯著高于PC區(P<0.05)。細菌群落多樣性受宿主影響較大[38]，如張瓊瓊等人研究發現，微生物多樣性與宿主呈現專一性，即宿主會在周圍環境中形成獨特的微環境并對細菌具有趨化和富集的作用，進而使得不同宿主對應了不同大小的細菌群落多樣性[39]。因此，養殖克氏原螯蝦(PC)和中華鱉(PS)的水體和沉積物中極有可能分別形成了獨特的微環境，如2種不同物種的排泄物、皮膚分泌物等對細菌分別具有獨特的趨化和富集作用。
導致PC和PS區的水體和沉積物間細菌群落種類和數量發生變化，進而使細菌群落多樣性與宿主呈現專一性，最終導致了PC和PS區細菌群落的α多樣性呈現顯著差異。Venn圖的結果顯示，細菌群落α多樣性更高的PS區中擁有更多的特有OTUs，這些OTUs可能就是在養殖中華鱉形成的特定微環境下定植并富集的。中華鱉還具有上岸曬背的習性，這一習性也可能將陸地中的細菌帶入到養殖水環境中，使特有OTUs數量增加，進而導致細菌群落多樣性升高[5，22]。
本研究統計了PC和PS區中特有OTUs的分類學信息，但由于目前認知所限，這些特有OTUs大多只能獲得較為粗糙的分類學信息，因此這些OTUs的特性大部分還不清楚，需要在后續的研究中進一步探究，以探明養殖作物的哪些生理特征或生活習性會導致哪些特有OTUs的定殖和富集。此外，環境中的營養濃度對細菌群落多樣性也有著較大影響[40]。研究表明，在營養濃度較高的養殖環境中，更低的營養負荷反而可能會造成更高的多樣性[41]。而本研究中細菌群落α多樣性更高的PS區中，水體TN、TP和COD均略低于PC區，沉積物TN、TP和OC均顯著低于PC區(P<0.05)。
這可能是克氏原螯蝦和中華鱉的生理特征、生活習性及管理方式的不同造成的。由于克氏原螯蝦的雜食性，在養殖過程中存在餌料的過量投放和產生大量排泄物等問題[42]。另一方面，中華鱉生長發育緩慢，餌料投放較少，并且其代謝緩慢[43]�？耸显r挖洞刨沙的習性會導致沉積物中的營養物質更容易釋放到水體中[21]。因此，養殖中華鱉的水環境更容易保持較低的營養負荷，使細菌群落α多樣性更高。綜上，由于PC和PS區宿主不同分別形成了獨特的微環境(排泄物、皮膚分泌物等對細菌獨特的趨化和富集作用)，及生理特征、生活習性和管理方式不同導致的水環境營養鹽負荷的差異，二者共同作用導致了PS區的細菌群落α多樣性顯著高于PC區。
4結論
(1)由于宿主的不同和營養濃度的差異，使得PC和PS區的水體和沉積物中細菌群落的α多樣性呈現顯著(P<0.05)差異。并且在水體和沉積物中，細菌群落α多樣性均為PS區顯著高于的PC區。
(2)養殖克氏原螯蝦(PC)和中華鱉(PS)造成的水體和沉積物理化指標差異，引起了養殖區域間細菌群落結構的差異。水體中的NH+4⁃N和NO-3⁃N是造成水體細菌群落組成差異的最主要環境因子，沉積物中的TN、TP和OC均對沉積物細菌群落組成有顯著影響(P<0.05)。
(3)PC和PS區的養殖水體中均檢測出了致病菌(黃桿菌屬和多核桿菌屬)，并且檢測出的致病菌均與NH+4⁃N和NO-3⁃N濃度顯著(P<0.01)正相關。
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作者：張弘杰1，3，徐慧敏1，3，過梓栩1，何斐2，∗，曾巾3，趙大勇1
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