本文摘要：摘要 為探究凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)工廠化循環水養殖系統的養殖水體水質情況以及微生物菌群的組成結構，本研究利用高通量測序技術和生物信息學分析手段，測定凡納濱對蝦工廠化循環水養殖過程一級移動床生物凈化、二級固定床生物凈化、養殖水體的水質指標、水
摘要 為探究凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)工廠化循環水養殖系統的養殖水體水質情況以及微生物菌群的組成結構，本研究利用高通量測序技術和生物信息學分析手段，測定凡納濱對蝦工廠化循環水養殖過程一級移動床生物凈化、二級固定床生物凈化、養殖水體的水質指標、水體和生物凈化載體以及對蝦腸道微生物菌群的組成。結果顯示，水體的氨氮(NH4+-N)和亞硝酸鹽氮(NO2–-N)質量濃度顯著降低，分別為 0.85 和 0.21 mg/L。養殖系統水體、生物凈化載體和蝦腸道樣品中共有的優勢菌為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，此外，一級、二級生物凈化系統水體中的放線菌門(Actinobacteria)為優勢菌，生物凈化載體中浮霉菌門(Planctomycetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)為優勢菌;對蝦腸道中的厚壁菌門(Firmicutes)為優勢菌。另外，對蝦養殖循環水系統中生物凈化載體上的細菌物種含量比水樣中的細菌物種少，但微生物多樣性高于養殖水體，生物凈化載體中微生物具有低豐度和高多樣性的特點。綜上所述，生物凈化系統可有效地增加水體中促進氮、磷代謝的微生物菌群，調控養殖水體的水質指標，研究結果為凡納濱對蝦工廠化循環水養殖系統構建及水質調控提供理論依據。
關鍵詞 凡納濱對蝦;工廠化循環水養殖;生物凈化;水質指標;微生物菌群
凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是我國最重要的對蝦養殖品種，2020 年凡納濱對蝦海水養殖產量達 119.7 萬 t，占全國蝦類海水養殖總產量的 80.5%(農業農村部漁業漁政管理局等, 2021)。凡納濱對蝦養殖產業的發展經歷了池塘養殖、溫棚養殖、高位池養殖、工廠化養殖等養殖模式(朱林等, 2019)。
隨著凡納濱對蝦集約化養殖技術的不斷發展，放養密度和飼料投喂量的增加，養殖動物的產量和養殖水域的利用率明顯提高(陳明康等, 2020)，但是大量殘餌、糞便、肥料和藥物的投入使養殖水環境日益惡化，負面環境效應非常突出，導致對蝦疫病肆虐橫行、環境污染嚴重(祁真等, 2004)。因此，發展無公害生態養殖，推動工廠化循環水養殖，高效可持續的生物凈化系統研究已成為當今凡納濱對蝦集約化養殖研究的熱點之一。
循環水養殖模式是將養殖水經物理、化學及生物凈化處理后重復使用的新型養殖方式(王峰等, 2013)，在水資源節約、養殖廢棄物處理、對蝦疾病控制以及減少生態污染等方面具有明顯的優勢(張龍等, 2019;張健龍等, 2017)。生物凈化是循環水水處理的核心環節，濾料是生物凈化設施的重要組成部分，不同濾料因為材質、比表面積、耐沖刷能力、水力特性等差異造成其表面生物群落的不一致，從而影響對養殖水的處理效果(蔡云龍等, 2005)。
而養循環水養殖系統中的有益微生物菌群在凈化水質、降低氨氮(NH4+-N)和亞硝態氮(NO2–-N)(邵青等, 2001; Fan et al, 2018)、營養循 環(Cornejo-Granados et al, 2018)、病原 防控(Rungrassamee et al, 2016)及養殖物種健康(樊英等,2017)等方面也發揮著重要的作用。目前的研究主要集中在生物凈化濾料的單因素對水質的效應研究，其對環境及養殖對蝦微生物菌群的研究較少。因此，本研究通過分析對蝦工廠化循環水養殖系統中水質指標、水體及對蝦腸道微生物菌群結構的變化，探討工廠化循環水系統生物凈化對水體養殖對蝦的影響效果，為對蝦工廠化循環水養殖系統和養殖模式的構建提供基礎參數。
1 材料與方法
1.1 養殖系統的組成與構建
實驗在海陽市黃海水產有限公司養殖基地進行，對蝦工廠化循環水養殖系統由原石斑魚(Epinephelinae)養殖車間進行升級改造，總面積為 800m2，有效養殖水體為 600 m3。8 個規格相同的水泥養殖池(長 9 m、寬 9 m、深 2 m, 養殖水體 600 m3)通過回水管道和進水管道與水處理系統相連構成封閉循環水養殖系統。水處理系統是由中國水產科學研究院海水陸基工廠化養殖創新團隊自主設計構建。
主要由2 個養殖池改建而成，一個養殖池分隔成泵池、微濾機池、一級移動床生物凈化池和綜合調節池 4 部分，一級移動床生物凈化池生物濾料為多孔 PE 填料(比表面積約 600 m2/m3);另一個養殖池分隔成二級固定床生物凈化池、紫外消毒池和集中增氧池 3 部分，二級固定床生物凈化池生物濾料為立體彈性填料(比表面積約 150 m2/m3)。整個養殖系統配備 2 臺 3.0kW、氣壓為 39.2 kPa 的羅茨鼓風機，滿足對蝦工廠化養殖 6.0 mg/L 以上的溶氧和生物凈化所需的溶氧與曝氣要求，養殖系統工藝流程。養殖用水為天然海水，經沉淀、砂濾、調溫、增氧處理后使用。
1.2 實驗設計實驗
凡納濱對蝦苗種由海南正泰一號水產種苗有限公司培育，實驗于 2020 年 10 月 16 日開始，初始放養密度為 500 尾/m3，蝦苗平均體質量為(0.6±0.1)g。各組養殖水循環量為 6 h 循環 1 次，每天 4 個循環，每天補充水量為水體的 3%左右。根據對蝦的生長情況，投喂不同顆粒大小的青島正大農業發展有限公司生產的凡納濱對蝦配合飼料(粗蛋白≥42%、粗脂肪≥4%、粗纖維≥3%)。
養殖實驗初期 22 d，投喂粒徑為 0.5 mm 的配合飼料，22 d 后，投喂粒徑為 1 mm的配合飼料，4 次/d，投喂時間分別為 07:00、12:00、17:00 和 22:00，日投喂量為對蝦體重的 10%，養殖后期投飼率降至 4%。在養殖實驗的第 80 天，采集一級移動凈化池水體(FMW)、二級固定床生物凈化池水體(SIW)、養殖池水體(PC)以及多孔 PE 填料(FMB)、立體彈性填料(SIB)和對蝦腸道樣品。
在上午投喂 4 h 后，從每個處理池分選擇池中心以及周邊兩點采集水面以下 50 cm處的水樣 500 mL，用 0.22 µm 聚碳酸酯過濾器過濾，濾膜放入無菌離心管–20℃冷凍保存用于分析微生物菌群結構，過濾后的水用于測水質指標;取一級移動床生物凈化池多孔 PE 填料 5 片，取二級固定床生物凈化池立體彈性填料 10 cm，分別用 500 mL 純凈水進行振蕩、抽濾，濾膜放入無菌離心管–20℃冷凍保存用于分析微生物菌群結構。隨機從 8 個養殖池中挑選 18 尾對蝦，分別采集腸道(LVT)樣品，混合成 3 個樣品放入無菌離心管，–20℃冷凍保存，用于分析微生物菌群結構。
1.3 測定與計算方法
1.3.1 水質指標 水體的水溫、溶氧、pH 和鹽度利用水質檢測儀(YSI556, 美國)測定;總氮(TN)、硝態氮(NO3–-N)、亞硝態氮(NO2–-N)和氨氮(NH4+-N)的濃度利用營養鹽流動分析儀(Skalar, 荷蘭)測定。
1.3.2 微生物菌群檢測 水體和對蝦實驗樣品中的微生物總 DNA 的提取采用 TAB/SDS 法進行，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品的基因組 DNA，檢測出清晰的 DNA 條帶，然后用 NanoDrop 2000c 微量核酸檢測儀 NC20 檢測其 DNA 純度，其 OD260 nm/OD280 nm=1.9~2.0，符合 Ilumina MiSep 測序要求。使用 16S rDNA基因 V4 區帶有 barcode 的特異引物對 DNA 進行 PCR擴增，引物為 515F (5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。PCR擴增在 ABI GeneAmp® 9700 型 PCR 儀中進行。PCR反應體系為 30 μL，包括 DNA 模板 10 ng、15 μL ofPhusion® High-Fidelity PCR Master Mix、0.2 μmol/L正反向引物。
PCR 反應程序為 98℃ 1 min;98℃10 s，50℃ 30 s，72℃ 60 s，30 個循環;72℃ 5 min。PCR擴增產物經 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，等比例混合后，利用 GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific)純化回收目的片段。使用 NEB Next® Ultra™ DNALibrary Prep Kit for Illumina (NEB, 美國)進行測序文庫構建。測序文庫經 Qubit@ 2.0 Fluorometer (ThermoScientific)和 Agilent Bioanalyzer 2100 system 檢測合格后，在 Illumina MiSeq 平臺進行測序。
1.3.3 生物信息學分析
利用 FLASH 軟件對基于barcode 所得樣品的有效序列進行質控過濾。使用UPARSE 軟件進行序列分析，并以≥97%的相似度定義操作分類單位(OTUs)。使用 UCHIME 軟件確定嵌合序列。利用 Mothur 軟件使用 97%相似度的 OTUs，利用 R 語言工具繪制所有微生物樣本稀釋曲線。使用Mothur 軟件根據 Chao1、辛普森(Simpson)和香濃(Shannon)指數計算菌群 α-多樣性。使用 R 語言工具分析和繪制維恩(Venn)圖，用于分析各組微生物樣本共有和獨有的 OTUs 數量。使用 R 軟件包基于加權和非加權 unifrac 距離的主坐標進行降維分析(PCoA)評估菌群 β-多樣性。
利用 R 語言工具在門和屬水平上分別統計細菌群落相對豐度。利用 Metastats 軟件分析各組細菌分類學的豐度差異。采用 LEfSe 軟件，使用線性判別分析(LDA)效應大小(LEfSe)分析，對不同組內的生物標志物進行定量分析。根據各個 OTU 的豐度概況，使用 Cytoscape 軟件構建菌群生態網絡。使用 RandomForest 軟件包進行 RandomForest 分析。生物信息學分析由明科生物技術(杭州)有限公司提供技術支持。
1.3.4 數據分析
所得數據以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，采用 SPSS 25.0 軟件進行方差分析(ANOVA)和多重比較(LSD 法和 Duncan 法)，P<0.05表示差異顯著。
2 結果
2.1 生物凈化系統對養殖水體水質的影響
生物凈化對循環水養殖系統水體無機營養鹽和有機質含量質量濃度的影響。凈化池和養殖池的水溫保持在 28.5℃左右，鹽度為 31 左右，pH 為7.8~8.2，溶氧保持在 5.0 mg/L 以上，系統內各水處理單元間差異不顯著(P>0.05)。二級固定床生物凈化池(SIW)養殖水體中的 NH4+-N 和 NO2–-N 質量濃度均顯著低于一級固定床凈化池(FMW)和養殖水池(PC)處理組(P<0.05)，其質量濃度分別在 0.85 和 0.21mg/L，FMW 與 PC 處理組水體中 NH4+-N 和 NO2–-N 的質量濃度差異不顯著(P>0.05)。不同水處理單元的 NO3–-N、硅 (Si) 、 TN 、 總 磷 (TP) 的質量 濃 度 差 異 不 顯 著(P>0.05)。結果表明，不同生物凈化處理對降低 NH4+-N和 NO2–-N 質量濃度具有顯著差異。
2.2 養殖系統菌群測序結果
經 16S rDNA 基因 V4 片段 Illumina MiSeq 測序并優化質控后，21 個微生物樣本共得 1 296 349 條有效序列，平均每個樣本 61 731 條，長度主要在 201~300 bp 之間，平均為 255 bp�；� 97%相似性水平劃分 OTUs 的稀釋曲線結果顯示，每個樣本測序深度超過 50 000 條 reads，且曲線趨于平緩，表明對蝦工廠化養殖系統的微生物測序深度已接近實際菌群情況，滿足下一步分析需求。
2.3 微生物豐富度和多樣性分析
基于對蝦工廠化養殖系統菌群 OTUs 繪制 Venn圖，用于分析各組 OTU 的相關性。結果顯示，所有的微生物樣品中共鑒定出 8276 個 OTU，所有的樣品共有的 OTU 為 183 個。生物凈化載體樣品(FMB、SIB)處理組中獨有 OTU 數高于水體樣品(FMW、SIW)，其中 SIB 處理組最高(P<0.05);對蝦 LVT 處理組的獨有 OTU 數量顯著高于水體樣品(FMW、SIW)(P<0.05)。為了評估不同處理間微生物群落的 α 多樣性，分析了 Chao1、Shannon 和 Simpson 指數，結果顯示，SIB 處理組的 Chao1 指數、Shannon 指數顯著高于對蝦 LVT 處理組的指數(P<0.05) 。
2.4 對蝦循環水養殖系統菌群結構分析
所有微生物樣品中共鑒定出 46 個細菌門，其中水體和蝦腸道中的優勢門不同。水體(FMW、SIW、PC)中優勢菌為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，生物凈化載體中優勢菌為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和浮霉菌門(Planctomycetes)，而對蝦腸道優勢菌為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門(Firmicutes)。
不同生物凈化載體(FMB 和 SIB)中浮霉菌門以及硝化螺旋菌門的豐度顯著高于其他處理組(P<0.05);對蝦腸道(LVT)中變形菌門和厚壁菌門豐度顯著高于水體和生物凈化載體(P<0.05)，而放線菌門豐度顯著低于水體和生物凈化載體(P<0.05)。在已鑒定的 947 個屬中，可以看出某些菌屬豐度在水體、生物凈化載體和對蝦腸道中存在明顯差異。
例如，弧菌屬(Vibrio)在生物凈化載體中豐度較低，而在水體(FMW、SIW)和腸道中豐度較高。從熱圖中可以看出，一級凈化水體中的弧菌屬的豐度高于二級凈化水體，而二級凈化水體高于養殖水體，浮霉菌屬(Planctomyces)的豐度在生物凈化載體樣品中比在水體和蝦腸道中要高，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的豐度在對蝦腸道的豐度最高，在水體中豐度最低，但在水體中含量極低。FMW、SIW、FMB 和 SIB 處理組中分枝桿菌屬(Mycobacterium)的豐度均高于腸道，腸道中的短波單胞菌屬(Brevundimonas)的豐度高于水體(FMW、SIW)和生物凈化載體樣品(FMB、SIB)中的豐度，LVT 處理組中潘多拉菌屬(Pandoraea)和葉桿菌屬(Phyllobacterium)的豐度高于水體和生物凈化載體。
3 討論
生物凈化在對蝦工廠化循環水養殖系統中具有重要的作用(徐如衛等, 2015)。本研究通過對比養殖水體和生物凈化載體上的細菌群落結構組成發現，二者的細菌群落結構組成基本一致。目前，在人工水產養殖系統中，由于放養密度高，投喂的飼料和糞便造成水中有毒的氨氮和亞硝酸鹽濃度上升，水體中的硝化細菌通過硝化作用可將氨轉變為亞硝酸、將亞硝酸轉變為硝酸，因此硝化細菌在循環水系統扮演著十分重要的角色(安曉宇, 2010)。
本研究的各級生物濾池中亞硝酸鹽含量水平相差不大，其濃度無明顯的積累現象，養殖系統氨氮和亞硝酸鹽濃度相對較低，且均在凡納濱對蝦安全養殖范圍內，循環水養殖系統中水質狀況良好。微生物作為水生生態系統的重要組成部分，有助于保持水質的穩定和水生動物的健康狀況(Raul et al,2003)。對蝦對營養物質的消化吸收依賴于腸道微生物群的穩定性，其失衡將直接影響到投喂飼料的利用、水產養殖環境的污染增加等問題(郁維娜等, 2018)。
因此，了解蝦類養殖生態系統的微生物特征，建立有效的微生物調控策略，對于對蝦工廠化養殖具有重要的作用。本研究中發現變形菌門、放線菌門和擬桿菌門是養殖水體樣品和生物凈化載體樣品中共同的優勢細菌門類，這與以前對竺山灣和湖泊水體的浮游細菌的研究結果一致(Eiler et al, 2004; Tamaki et al, 2005; 薛銀剛等, 2018)，也與譚八梅等(2021)發現的遼寧長海刺參養殖池塘水體菌群同季節第一優勢菌門均為變形菌門，次優勢菌門為擬桿菌門相一致。
且變形菌門在腸道中的豐度高于在水體和生物凈化載體中，變形菌門是一種多功能細菌，在廢水中具有很高的豐度，能夠去除氮和磷，降解有機物和減少化學需氧量(Cottrell et al, 2000; Klase et al, 2019)。本實驗中，變形菌門在腸道中的豐度高于水體，生物凈化載體中豐度最低;放線菌可降解有機物，包括淀粉、蛋白質等大分子，并產生抗生素等抗菌物質(Wexler, 2007;Zothanpuia et al, 2018)。
本研究中，水體中放線菌門豐度很高，而在對蝦腸道內含量較低，有利于養殖水體有機物和氮的分解。擬桿菌門包括擬桿菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱三大類，其中擬桿菌綱主要存在于動物腸道和糞便中，可有效促進碳水化合物的代謝(Shin et al, 2015);而黃桿菌綱主要存在于水生環境中，鞘脂桿菌綱的重要類群為噬胞菌屬(Cytophaga)，在海洋細菌中占有較大比例，可降解纖維素。本研究中，擬桿菌門在水體、生物凈化載體和腸道中的豐度差別不明顯，但可以看出在養殖水體中含量較高。
4 結論
生物凈化在凡納濱對蝦循環水養殖系統中的應用可降低對蝦循環水養殖系統中 NH4+-N 和 NO2–-N 質量濃度，有效調控養殖水體水質指標。水體、生物凈化載體以及對蝦體內的優勢菌群不同，變形菌和擬桿菌在水體、生物凈化載體和腸道中均占優勢，而浮霉菌主要聚集于生物凈化載體，厚壁菌主要定植在腸道中，放線菌主要存在于水中。不同養殖環境微生物種類分布特征可為對蝦循環水養殖微生物資源開發和養殖水質調控提供理論依據。
參 考 文 獻：
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作者：宮 晗 1,2 陳 萍 2① 秦 楨 2,3 劉 洋 2,4高 煥 1,2 李吉濤 2 李 健 2 朱建新 2
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