肥桃流膠病病原鑒定

　　摘要:肥桃Prunuspersica‘Feicheng’是我國獨特的桃品種，肥桃流膠病近年來發生嚴重，對肥桃產業造成了重大損失。為探究肥桃流膠病病原，2016—2018年通過對山東肥城5個主要肥桃產區不同季節125個典型病斑進行分離培養和鑒定，并經病原菌的培養學、形態學、ITS序列及致病性測定，認為肥桃流膠病主要由Botryosphaeriadothidea和Fusariumlateritium兩種病菌引起，為肥桃流膠病病原的首次系統鑒定。

　　關鍵詞:桃流膠病;病原鑒定;葡萄座腔菌;鐮孢菌

　　肥桃Prunuspersica‘Feicheng’是山東省肥城市乃至全國獨特的桃品種，是中國水果名優特產之一。種植面積達到了近7000hm2，年產量1.6億公斤，經濟和社會效益顯著。近幾年來，肥桃流膠病發生嚴重，對肥桃的生產、銷售造成了極大影響。多數學者認為桃樹流膠病是生理現象，屬于非侵染性病害[1]。20世紀70年代，Weaver第1次分離出Botryosphaeriadothidea，人們才發現真菌可導致桃樹流膠病的發生[2]。

　　1863年葡萄座腔菌屬才被正式定義[2]。在上海、廣州、湖北等南方桃產區陸續發現Physalosporapersicae[3]、Botryosphaeriadothidea[4]、Cucurbitaria[5]、Leptosphaeria[5]等屬真菌也導致桃流膠病。多種報道認為葡萄座腔菌屬真菌Botryosphaeriaspp.可引起桃流膠病[6-9]。B.dothidea進入寄主組織可通過皮孔，氣孔或樹皮上小的傷口途徑侵入[10]。

　　大量研究表明，溫度、濕度是影響桃流膠病發生的重要因素[11]，氣溫高、降雨量大是春夏桃流膠暴發的主要原因，入冬后，低溫、少雨等因素抑制病害發生[12-17]。筆者首次對肥城桃樹流膠病的發病情況進行了全面調查，通過大量樣本采集和分離鑒定明確了肥桃流膠病病原的分類地位，以期為肥桃流膠病的科學防控提供參考依據。

　　1材料與方法

　　1.1試驗方法

　　1.1.1發病情況調查

　　2017年9月在肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺村景區、南尚里村和桃園鎮肥桃種植區5個主要肥桃產區中選取多年生桃樹，每個肥桃產區按照東南北四個方位分別選取4個桃園，每個方位的桃園選取15棵樹勢相似、栽培條件相同的桃樹進行桃流膠病的發病率及發病程度的調查與統計。每次每個種植區調查60株，計算發病率和病情指數。發病率(%)=發病總株數/調查總株數×100病情指數=∑(各級病株數×相應病級值)/(調查總株數×最高病級值)×100桃流膠病發病程度的分級標準，參考羅江會[1]制定的桃流膠病害分級標準。

　　1.2樣本采集

　　2016—2018年共6次在山東省肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺村景區和南尚里村、桃園鎮肥桃種植區5個主要肥桃產區，分別選取典型桃園內5個采樣點的不同方位(東、南、西、北、中)，采用隨機取樣的方法，在每個桃園采集5組具有典型癥狀的病枝，共計125個病枝作為試驗材料并編號。

　　1.3病原菌的分離與純化

　　采用組織分離法進行病原菌分離[18]。每個病枝分離25個病健交界組織，放置于PDA平板放入28℃生化培養箱培養[19]。5d后，觀察病組織分離情況，統計微生物的種類和數量。將上述分離的微生物，按照不同類型進行純化培養，獲得單一的微生物。

　　1.4病原菌的鑒定

　　1.4.1培養特性觀察

　　分離純化的菌株繼續在28℃下培養。觀察記錄菌絲形態、菌落邊緣特征、菌落顏色變化特征。

　　1.4.2形態學特性觀察

　　供試菌株在PDA培養基上觀察其子實體大小、顏色等形態，顯微鏡下觀察病菌分生孢子器和分生孢子大小、形狀和顏色等形態，分別測定100個分生孢子器和分生孢子。

　　1.4.3ITS序列鑒定

　　采用2×CTAB法進行基因組的DNA提取，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGT￣GAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT￣TATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[20]，經過瓊脂糖凝膠電泳，將上述所獲得的PCR產物經純化后送公司測序，獲得的序列與GenBank核酸數據庫中相關菌株進行比對，用MEGA5.0軟件構建系統發育樹，對ITS基因序列數據進行NJ(NeighborJoin￣ing)分析，以啟發式搜索獲得系統發育樹，鑒定病原菌種類和分類地位。

　　1.5致病性測定

　　從7種類型的分離菌株中各挑選1個典型菌株分離純化后，選取3個菌株重復，按照柯赫氏法則，分別接種到與分離物來源一致的肥城紅里桃2a生健康枝條上，7d后確定分離物致病性。采用離體刺傷接種法。剪取紅里肥桃15cm長的2a生枝條，用清水沖洗后用75%酒精進行表面消毒，無菌水漂洗3次后用吸水紙吸干水分;用無菌針在枝條中間部位針刺5針，將準備好的菌絲塊接種于傷口處，以PDA瓊脂塊同樣處理接種為對照;于25℃條件下培養。測量7d時枝條病斑長度，比較不同分離菌株的致病力大小，根據柯赫氏法則，對枝條發病病斑進行再分離，觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

　　2結果與分析

　　2.1肥桃流膠病發病情況

　　基于2017年對5個主要肥桃產區的肥桃流膠病田間癥狀調查，肥城市肥桃流膠病發生較為嚴重，肥城桃產區平均發病率為61.77%，最高發病率88.0%;平均病情指數為24.9，最高病情指數為26.9。

　　2.2肥桃流膠病病原鑒定

　　2.2.1采集分離純化獲得的病原菌株2016—2018年通過對125個病枝分離純化后共獲得160個菌株，根據培養特征分為7個類型，其分離純化結果。類型1和類型4是病斑上分離到的優勢菌株，其他菌株是偶發的菌株。

　　2.2.2病斑分離物菌落培養特性

　　類型1菌株生長較為旺盛，菌落生長速度快，菌絲呈棉絮狀;中部菌絲較外緣菌絲旺盛，菌絲初為白色，后由中心向四周輻射狀變黑;最終整個菌落呈現墨黑色。類型2菌株菌絲生長相對平緩，菌落扁平;菌絲初為白色后顏色逐漸變深直至變為黑色。類型3菌株菌絲生長非常旺盛，后期菌絲可生長至培養皿頂端，整個菌落呈棉絮狀，菌絲顏色變化為先白后黑。類型4菌株菌絲生長平緩，呈絨毛狀，菌絲初為白色，后逐漸呈輻射狀變紅，直至整個菌落呈磚紅色。類型5菌株菌絲白色，生長平緩;外圍菌絲較內部菌絲旺盛。類型6菌株菌絲白色，匍匐，中部菌絲比四周菌絲生長旺盛。類型7菌株菌絲疏松、生長旺盛，菌落外圍一圈菌絲生長旺盛，菌絲顏色初為白色，后逐漸變為淺紅色。

　　2.2.4病原菌分子鑒定

　　從分離菌株的rDNA￣ITS的PCR擴增、BLAST序列比對結果可以看出類型1(菌株T1、T9、T15、T16、T19、T22)與Botry￣osphaeriadothidea序列相似性100%;類型2(菌株L11)與Lasiodiplodiatheobromae的序列相似性98%;類型3(菌株T7)與B.obtusa(無性態為Diplo￣diaseriata)的序列相似性99%;類型4(菌株F27-2、F8-2)與Fusariumlateritium的序列相似性100%;類型5(菌株F11-3)與F.fujikuroi的序列相似性100%;類型6(菌株F3-3、F44-2、F13-2、F39-3)與F.proliferatum的序列相似性100%;類型7(菌株F38-2)與F.oxysporum序列相似度100%。

　　3討論與結論

　　綜合肥桃流膠病病斑分離物的培養學、形態學、ITS序列及致病力測定，明確了肥桃流膠病可由7種真菌引起，包括B.dothidea、B.obtusa、Lasiodip￣lodiatheobromae、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium，其中B.dothidea和F.lateritium是優勢種，其他均是偶發種，這7種病原菌間的互作及其與肥桃流膠病的關系，尚需繼續研究。

　　本研究中共分離出鐮孢菌類菌株4種，為F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateri￣tium，在肥桃流膠病病原研究中，這是首次發現鐮孢菌類真菌為致病菌。F.lateritium分離率最高，為優勢病原菌。但在鐮孢菌類菌株致病性測定試驗中，F.lateritium的致病力卻最低。F.fujikuroi與F.proliferatum的致病性差異不大，明顯高于F.lateritium與F.oxysporum兩類菌株。但鐮孢菌種類病原菌無論分離率還是致病性均低于葡萄座腔菌。

　　本實驗中，鐮孢菌類菌株的分離比率明顯低于葡萄座腔菌菌株，并且在分離過程中發現，鐮孢菌類菌株與葡萄座腔菌菌株全部相伴而生，沒有發現鐮孢菌類菌株單獨被分離的現象，由此推論葡萄座腔菌類菌株是肥桃流膠病主要病原菌，鐮孢菌類菌株是伴生病原菌，可混合侵染危害。

　　參考文獻:

　　[1]羅江會.桃流膠病的發生及其病原菌研究[D].重慶:西南大學，2006.

　　[2]WEAVERDJ.AgummosisdiseaseofpeachtreescausedbyBotryosphaeriadothidea[J].Phytopathology，1974，64(11):1429-1432.

　　[3]方中達.植病研究方法[M].3版.北京:中國農業出版社，1998:124.

　　[4]BRITTONKO，HENDRIXFF.ThreespeciesofBotryospha￣eriacausepeachtreegummosisinGeorgia.[J].PlantDisease，1982，66(1):1120.

　　[5]蓋鳳珍.疑似桃流膠病病菌侵染新梢形態觀察及鑒定[D].武漢:華中農業大學，2016.

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　　摘要：我國是一個農業大國，也是一個人口大國，保證農產品的綠色健康關系到人民的身心健康發展，而農業發展中的一個巨大威脅就是病蟲害帶來的威脅，在傳統的方法下，通過農藥噴灑來殺蟲的方法會帶來較大的化學殘留，這不僅有損群眾的身體健康，還嚴重降低了我國的農業發展水平，降低了農產品在世界范圍上的競爭力，因此發展綠色的防控技術，是對當下時代新農業的發展要求。

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